Velocidad de consumo de sustrato.
Categoría: 2. Ciencia y tecnología.
En la elaboración de este protocolo el autor de este blog contó con la amable colaboración de la profesora M. en C. Yuriana Martínez Orea. Profesora de asignatura en la Facultad de Ciencias de La UNAM.
Objetivo.
Medir la velocidad de consumo de sustrato (glucosa) en la fermentación de una solución de carbohidratos (sacarosa o almidón) o en una bebida fermentada (pulque o tepache).
Principio.
La respiración es el proceso de oxidación de un carbohidrato (glucosa) por reacciones metabólicas para la obtención de energía, en forma de adenosina trifosfato (ATP).
La respiración aerobia comprende tres procesos principales que son: 1) la glucólisis; 2) el ciclo de Krebs; y 3) la cadena de transporte de electrones. Sólo en el tercer proceso se consume oxígeno. El primero de estos procesos se lleva a cabo en el citopasma de las células eucariotas y en el citoplasma de bacterias, mientras que el segundo y el tercero se llevan a cabo dentro de la mitocondria de las células eucariotas y en el citoplasma en el caso de bacterias.
La fermentación es un proceso de respiración anaerobia y comprende dos procesos principales: 1) la glucólisis; y 2) la reducción del piruvato (regeneración del NAD+) y síntesis de etanol o ácido láctico. Estos procesos se realizan en el citoplasma de la célula eucariota y en el citoplasma de las bacterias.
La glucólisis es un proceso metabólico anaerobio en el que la glucosa (C6H12O6) se oxida a dos moléculas de piruvato (C3H4O3).
La reducción del piruvato es un proceso en que el piruvato se transforma en dos moléculas de acetaldehído (2 carbonos) por la piruvato descarboxilasa con liberación de 2 moléculas de CO2. A continuación se da la reducción de este compuesto con la oxidación de 2 moléculas de NADH2, seguido por la formación de etanol por la etanol descarboxilasa.
En la fermentación se liberan dos moléculas de CO2 por cada mol de glucosa que entra en el proceso. Cuando el CO2 se disuelve en agua con pH=8.3, se consume bicarbonato (HCO3-, pka=10.32) por la formación de ácido carbónico (H2CO3, pka=6.38) y el pH comienza a descender.
Las sustancias utilizadas como indicadoras, son sustancias que sufren algún cambio visible bajo determinadas condiciones de pH o de potencial redox. La fenolftaleína es una sustancia que cuando está en solución acuosa toma un color rosado y luego violeta en condiciones de pH>8.3. Cuando el pH se hace menos alcalino, la solución acuosa es transparente. En la práctica se utiliza esta propiedad para fijar un punto como referencia. De manera que al llevar un sistema de composición desconocida a la condición indicada por la fenolftaleína, podemos conocer una propiedad de la solución problema. Como su grado de acidez o basicidad o su condición
oxidante o reductora.
Procedimiento.
1. En un vaso de precipitados de 500 mL se colocan 250 mL de agua destilada. Se agregan una a dos gotas de fenolftaleína. Se agregan unas gotas de hidróxido de sodio 0.01N hasta que se observe un cambio de coloración o viraje (transparente a rosado). A continuación medir 1.0 mL de solución de hidróxido de sodio y agregarlo también. Así se tiene un exceso conocido de hidróxido de sodio.
2. Una muestra de 100 mL de bebida (pulque fermentado) se coloca en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Se coloca un tapón de hule con un orificio en donde se coloca un tubo de vidrio de 0.5 cm de diámetro, que no alcance a tocar la superficie del líquido. El tubo de vidrio debe estar doblado en forma de una “U” amplia (ver aparato en la Figura 1-a). Se coloca a un lado el vaso de precipitados con la solución de hidróxido de sodio y se deja que por la punta del tubo de vidrio burbujee el gas que sale del matraz Erlenmeyer, producto de la fermentación de la bebida (pulque).
3. Se inicia un cronómetro y se espera hasta que la solución de hidróxido de sodio (color violeta al inicio) cambie de color hasta hacerse transparente. En ese momento se detiene el cronómetro.
Cálculos.
Consumo de glucosa.
Como se dijo antes, cada mol de glucosa que se fermenta genera dos moléculas de CO2. Cada molécula de CO2 a su vez genera un mol de ácido carbónico (H2CO3). Así, cuando se ha consumido el hidróxido de sodio que se agregó en exceso, se habrá consumido la siguiente cantidad de glucosa:
Glu = PMGlu*VolNaOH*NNaOH / (2*VolBebida)
donde:
Glu= glucosa consumida (g*L^-1).
PMGlu= peso molecular de la glucosa (180.0552 g*mol^-1).
VolNaOH= volumen de hidróxido de sodio en exceso (0.001L).
NNaOH= normalidad de la solución de hidróxido de sodio (0.01).
VolBebida= volumen de bebida colocado en el matraz Erlenmeyer (0.1L).
Velocidad de consumo de glucosa.
Como se determinó el tiempo que tardó la muestra de bebida en consumir la cantidad de glucosa calculada en el paso anterior, es posible calcular la velocidad de consumo de glucosa, de la siguiente manera:
VGlu= Glu / t
donde:
VGlu= velocidad de consumo de glucosa (g*L^-1*min^-1).
Glu= glucosa consumida (g*L^-1).
t= tiempo (min).
Nota: Una muestra con 10 g*L^-1 de glucosa y una velocidad de consumo de glucosa (ver gráfico en Figura 1-b) tardaría 25 minutos en consumir el exceso de hidróxido de sodio 0.01N.
Generación de etanol.
Cada mol de glucosa que se fermenta genera dos moléculas de CO2 y dos moléculas de etanol (C2H6O). Cada molécula de CO2 a su vez genera un mol de ácido carbónico (H2CO3). Así, cuando se ha consumido el hidróxido de sodio que se agregó en exceso, se habrá formado la siguiente cantidad de etanol:
Eth = PMEth*VolNaOH*NNaOH / (VolBebida)
donde:
Eth= etanol formado (g*L^-1).
PMEth= peso molecular del etanol (46.0196 g*mol^-1).
VolNaOH= volumen de hidróxido de sodio en exceso (0.001L).
NNaOH= normalidad de la solución de hidróxido de sodio (0.01).
VolBebida= volumen de bebida colocado en el matraz Erlenmeyer (0.1L).
Velocidad de formación de etanol.
Como se determinó el tiempo que tardó la muestra de bebida en sintetizar la cantidad de etanol calculada en el paso anterior, es posible calcular la velocidad de formación de etanol, de la siguiente manera:
VEth= Eth / t
donde:
VEth= velocidad de formación de etanol (g*L^-1*min^-1).
Eth= etanol formado (g*L^-1).
t= tiempo (min).
Resultados.
- Tipo de muestra: Indicar tiempo transcurrido desde el inicio de la fermentación hasta el momento de realización del experimento.
- Tiempo para el viraje de color.
- Velocidad de consumo de sustrato (glucosa).
- Velocidad de formación de etanol (producto).
Conclusiones.
Las soluciones indicadoras nos permiten identificar puntos de referencia para conocer una o más propiedades de la solución problema.
Al medir la velocidad de formación de CO2 en una muestra de bebida (pulque) en fermentación, conociendo el tiempo que toma al gas que genera la muestra (CO2) consumir el hidróxido de sodio en exceso añadido, es posible conocer las velocidades de consumo de sustrato (glucosa) y de formación de productos (etanol y CO2).
Es posible medir la velocidad de consumo de sustrato (glucosa) en una fermentación, midiendo el tiempo que toma al gas (CO2) consumir el hidróxido de sodio en exceso añadido a la solución.
Es posible medir la velocidad de formación de etanol (producto) en una fermentación, midiendo el tiempo que toma al gas consumir el hidróxido de sodio en exceso añadido a la solución.
Anexos.
Preparación de 1.0 L de solución de hidróxido de sodio (0.01N).
- Matraz aforado de 1000 mL.
- Vaso de precipitados de 1000 mL.
- Varilla de vidrio.
- Balanza analítica.
- Micro-espátula.
- Hidróxido de sodio grado reactivo.
- Agua destilada.
Procedimiento.
Pesar 0.3999 g de hidróxido de sodio grado reactivo en la balanza analítica, teniendo precaución de utilizar lentes de policarbonato. Disolver esta cantidad de hidróxido de sodio en unos 100 mL de agua destilada en el vaso de precipitados. Es recomendable tener una pequeña tina con agua corriente para enfriar el vaso de precipitados, así evitar que la solución alcance el punto de ebullición.
A continuación verter esta solución en el matraz aforado de 1000 mL, enjuagando una o dos veces el vaso de precipitados con agua destilada incorporándola al matraz aforado.
Para terminar, aforar a 1000mL con agua destilada. Almacenar la solución en un frasco de vidrio con tapa esmerilada de 1000 mL de capacidad. Etiquetar indicando la fecha, la composición, el nombre del compuesto y el nombre de la persona que preparó la solución.
Pesos atómicos:
C=12.01; H=1.0001; O=15.999; Na=22.9898.
A
B
Figura 1. a) Aparato para captura del CO2 en solución de hidróxido de sodio; b) Cinética de una fermentación alcohólica (g/L*h vs. tiempo). Fuente: http://www.lallemandwine.com/IMG/pdf_Fermaid_O_esp.pdf.
